HUBUNGAN POLIMORFISME GEN TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA (TNF-α) DENGAN AKNE VULGARIS RINGAN DI MAKASSAR

HUBUNGAN POLIMORFISME GEN TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA (TNF-α) DENGAN AKNE VULGARIS RINGAN

DI MAKASSAR

 


OLEH

NUR RAHMAH. S. MATHAR

PROGRAM STUDI ILMU KESEHATAN KULIT DAN KELAMIN

PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2011

 

BAB I

PENDAHULUAN

  1. A. LATAR BELAKANG MASALAH

Akne vulgaris (AV) merupakan penyakit inflamasi kronik pada folikel pilosebasea yang sering mengenai remaja dan dewasa. Ditandai terdapatnya komedo, papul, pustul nodul dan juga sampai skar. Komedo merupakan tanda awal dari lesi pada akne. Papul dan pustul terjadi akibat inflamasi sehingga memberikan gambaran eritem dan edema yang kemudian dapat membesar membentuk nodul. Akne vulgaris biasanya mengenai daerah wajah dada, bahu lengan dan punggung. (Zaenglein et.al., 2008, Baz et.al., 2008)

Meskipun penyebab utama dari AV tidak diketahui, berbagai faktor diduga terlibat dalam patogenesis penyakit ini. Patogenesis penyakit ini meliputi beberapa hal diantaranya overproduksi kelenjar sebasea, keratinisasi folikel yang abnormal, inflamasi, respon imun tipe lambat, faktor-faktor eksternal meliputi stress, merokok, minum alkohol, makanan, genetik serta proliferasi Propionebactrium acnes (P. acnes) dimana semua faktor ini saling mempengaruhi.

Dinding sel P. acnes mengandung antigen karbohidrat yang menstimulasi pembentukan antibodi, antibodi antipropionibakterium ini memicu proses inflamasi dengan mengaktifasi komplemen yang kemudian mengawali terjadi suatu cascade proinflamasi. P. acnes juga memicu inflamasi melalui elisitasi respon hipersensitifitas tipe lambat dan dengan memproduksi lipase, protease, hialuronidase dan faktor kemotaktik sehingga merupakan sumber utama dari enzim lipase folikuler, protease, dan hialuronidase, P acnes juga menstimulasi Toll like receptor 2 (TLR 2) pada monosit dan sel polimorfonuklear (PMN) disekitar folikel sebasea. Setelah terjadi ikatan TLR 2 kemudian melepaskan sitokin-sitokin proinflamasi seperti IL-I, IL-8, IL-12 dan tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). Keterlibatan inflamasi telah dibuktikan dengan adanya sitokin proinflamasi, salah satu yang paling berperan adalah tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) dalam proses respon inisiasi dan regulasi respon inflamasi. (Baz et.al., 2008, Zaenglein et.al., 2008)

Gen TNF-α lokasinya berada pada kromosom 6 (6p21.3) diantara HLA-B dan DR di regio klas III pada major histocompatibility complex (MHC). Polimorfisme gen TNF-a terutama terdapat pada posisi -308 dan -238. Polimorfisme ini sangat mempengaruhi respon sitokin-sitokin proinflamasi, adanya mutasi pada gen TNF-a agen inflamasi yang ditimbulkan makin berat. (T Hohler, 2002, Baz et.al., 2008)

Berdasarkan Combined Acne Severity Classification oleh Lehmann dkk.(2002) tingkat akne vulgaris dibagi menjadi akne ringan, sedang, dan berat. Dikatakan akne vulgaris berat bila jumlah kista lebih dari 5, atau jumlah komedo lebih dari 100 atau jumlah lesi inflamasi lebih dari 50 atau total lesi lebih dari 125 buah sedangkan akne vulgaris ringan bila jumlah komedo kurang dari 20 atau lesi inflamasi kurang dari 15 atau lesi total berjumlah kurang dari 30 buah.(Lehmann et.al., 2002)

Namun, selama ini belum diketahui mengapa akne dapat memberikan gambaran klinis ringan sampai berat. Kepustakaan menyebutkan adanya keterlibatan genetik dan inflamasi pada saudara kembar mempengaruhi hal tersebut. (T Hohler, 2002, Baz et.al., 2008)

  1. B. RUMUSAN MASALAH

Berdasarkan uraian dalam latar belakang masalah tersebut di atas, dapat dirumuskan pertanyaan penelitian sebagai berikut: “Apakah terdapat hubungan polimorfisme promoter gen tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) -308 dengan akne vulgaris ringan di Makassar”

 

  1. C. HIPOTESIS PENELITIAN
  1. Terdapat mutasi polimorfisme promoter gen TNf-α -308 pada pasien akne vulgaris ringan.
  2. Frekuensi polimorfisme promoter gen TNf-α -308 pada pasien akne vulgaris ringan lebih tinggi dibandingkan frekuensi polimorfisme promoter gen TNf-α -308 pada pasien kontrol.

 

  1. D. TUJUAN PENELITIAN
    1. 1. Tujuan Umum

Mengetahui hubungan antara polimorfisme promoter gen TNf-α     -308 dengan akne vulgaris ringan di Makassar.

 

  1. 2. Tujuan Khusus
    1. Mendeteksi adanya polimorfisme promoter gen TNf-α -308 pasien akne vulgaris ringan.
    2. Mendeteksi adanya polimorfisme promoter gen TNf-α -308 pasien kontrol.
    3. Mendeteksi apakah ada hubungan antara subseptibilitas individu terhadap akne vulgaris ringan dengan polimorfisme promoter gen   TNf-α -308.
  2. E. MANFAAT PENELITIAN
    1. Memberikan informasi bahwa terdapat hubungan antara polimorfisme genetik seseorang terhadap kerentanan terhadap akne vulgaris ringan.
    2. Data dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan untuk penelitian lebih lanjut mengenai faktor-faktor inflamasi yang berperan terhadap terjadinya akne vulgaris ringan.
    3. Data dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan untuk penatalaksanaan pasien akne vulgaris ringan.

 


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

  1. A. AKNE VULGARIS
    1. 1. Definisi

Akne vulgaris adalah penyakit yang dapat sembuh sendiri pada unit pilosebasea dan ditemukan terutama pada remaja. Umumnya kasus akne memberikan gambaran lesi pleomorfik berupa komedo, papul, pustul dan nodul.(Zaenglein et.al., 2008) Walaupun akne dapat sembuh sendiri, akibat yang ditimbulkan dapat dialami beberapa tahun dan hasilnya dapat merusak penampilan bahkan dapat menimbulkan lubang dan skar hipertrofi yang permanen, hingga mengakibatkan problem emosional dan penarikan diri dari lingkungan sosial bahkan dapat terjadi depresi.(Zaenglein et.al., 2008, Leyden, 1998, Ballanger et.al., 2006)

 

  1. 2. Insiden dan Prevalensi

Insiden akne vulgaris pada laki-laki sama pada wanita dengan tendensi wanita lebih cepat dibandingkan laki-laki, dengan puncak kejadian akne berdasarkan manifestasi klinik terjadi saat umur 18 tahun pada keduanya.(Hunter J, 2003) Prevalensi AV berkisar antara 81 – 95% pada laki-laki dewasa dan 79 – 82% pada gadis.(Goulden et.al., 1999) Lesi awal pada wanita berkisar antara umur 14-17 tahun sedangkan pada laki-laki antara umur 16-19 tahun. Umumnya akne menghilang secara spontan pada umur 20-25 tahun, walaupun sejumlah individu bisa tetap menderita sampai dewasa. (HARPER JC, 2008) Akne vulgaris yang berat sering terlihat pada laki-laki dan perokok. (Sidiropoulos, 2006, Guy, 2002)

Goulden dkk., menyatakan lebih lanjut bahwa prevalensi klinis akne pada umur 25-34 berkisar 16% pada wanita dan 6% pada laki-laki. Prevalensi ini tidak signifikan menurun antara umur 35 hingga 44 tahun tetapi menurun secara bertahap setelah umur 45 tahun dan berpengaruh hanya 2% pada wanita dan 1% pada laki-laki. Hal ini tidak jelas mengapa akne tetap ada pada umur pertengahan dengan persentase kecil dari populasi, terutama wanita.(Goulden et.al., 1999)

Di Amerika Serikat penyakit ini diderita oleh 40 – 50 juta penduduk setiap tahunnya (Leslie, 2002) dan angka kunjungan pada dokter ahli sebesar 20% dari seluruh kunjungan. (Leyden, 2003)          Di Indonesia berdasarkan catatan Kelompok Studi Dermatologi Kosmetik Indonesia (KSDKI) tercatat pada tahun 2002 kasus AV sebanyak 23,6% dan 23,8% pada tahun 2003. Sedangkan data penderita AV dari poliklinik Kulit dan Kelamin RS Wahidin Sudirohusodo Makassar dari 01 Januari 2003 – 31 Desember 2007 sebanyak 393 penderita.(Unhas, 2007)

 

  1. 3. Etiopatogenesis

Akne vulgaris merupakan proses yang dinamis dan multifaktorial yang melibatkan unit pilosebaseus. Faktor utama yang bertanggung jawab pada perkembangan lesi akne adalah

  1. a. Tahap pertama : Hipersekresi sebasea

Kelenjar sebasea dan hormon, Sebocyte memiliki sistem enzim yang dibutuhkan untuk mensintesis androgen secara de novo dari kolesterol atau mengubah androgen lemah menjadi derivat yang lebih kuat. Aktivitas enzim-enzim tersebut meningkat dalam kelenjar sebasea pasien penderita akne. Secara in vitro, telah dibuktikan bahwa respon sebocyte (proliferasi) terhadap stimulasi oleh testosteron dan dehidrotestosteron berbeda-beda dibandingkan dengan sebocyte dari bagian tubuh lainnya. Proliferasi tersebut tergantung dosis. Ini berarti bahwa sensitivitas kelenjar sebasea terhadap hormon tergantung pada lokasinya. Data ini menegakkan peran sentral sensitivitas androgen dalam akne. (Pawin et.al., 2004)

Distribusi 5a reduktase, Aktivitas 5a reduktase bervariasi sesuai dengan regio kutaneus dan sangat aktif pada wajah dan kulit kepala (tipe I), namun kurang aktif pada bagian tubuh lainnya yang tidak berjerawat (tipe II). Penemuan tersebut menjelaskan dominasi akne wajah. (Pawin et.al., 2004)

Peroxisome proliferators-activated receptors (PPAR), PPAR a,b dan g ditemukan dalam sebocyte, dimana g merupakan bentuk terpenting. Asam lemak bebas, asam linoleat dan androgen mengaktivasi reseptor-reseptor tersebut yang berikatan dengan reseptor RXR retinoid yang mengiduksi modifikasi proliferasi sebocyte dan differensiasi, serta sintesis asam lemak tersebut. Biasanya, mereka terlibat dalam maturasi kelenjar sebasea dan inisiasi reaksi inflamasi dalam akne. (Webster, 2007, Pawin et.al., 2004)

Peran neuro mediator dalam hiperseborrhea, Selain reseptor androgen, kelenjar sebasea memiliki reseptor substansi P yang merupakan neuro mediator. Secara in vitro, substansi P menstimulasi sekresi keringat. Substansi P ini diproduksi oleh ujung saraf peri-sebasea yang memiliki substansi P dalam jumlah besar pada pasien penderita akne dibandingkan pada orang sehat. Substansi P menstimulasi produksi endopeptidase neural dalam sebocyte dan selektin–E disekitar kelenjar sebasea. Hiperseborrhea diinduksi oleh stres, suatu fenomena yang disadari pasien, mungkin disebabkan oleh produksi substansi P. (Pawin et.al., 2004)

Komposisi sebum, sebocyte dalam kelenjar sebasea memproduksi asam lemak bebas, tanpa intervensi P.acnes. Dalam hiperseborrhea, komposisi sebum mengalami modifikasi, terutama penurunan konsentrasi asam linoleat akibat dilusi. Sehingga presentase squalene dalam folikel pilosebasea bertambah, pada makanan kaya lemak, terutama lemak tak jenuh. Kemungkinan hal ini merupakan awal hubungan antara diet dan jerawat.(Pawin, 2004)

Peningkatan produksi sebum menyebabkan defisiensi asam linoleat dalam folikel sehingga menurunkan fungsi barrier epidermal dan penurunan ini diduga terlibat meningkatkan bakteri komensal manusia yaitu P. acnes. Kolonisasi P.acnes kemudian akan mensekresi beberapa produk proinflamasi termasuk lipase, protease, hyaluronidase dan faktor kemotaktik. Faktor kemotaktik ini kemudian akan mengikat sel sistem imun seperti neutrofil, monosit, dan limfosit yang akan menstimulasi sitokin proinflamasi seperti TNF-a, IL-la, granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), IL-I b dan IL-8. (Pawin et.al., 2004. Baz et.al., 2008, Sidiropoulos, 2006)

 

  1. b. Tahap kedua : Pembentukan Komedo-mikro

Peran hormon, Secara in vitro, telah dibuktikan bahwa kombinasi aktivitas 5a reduktase tipe I dan 17b hidroksisteroid dehidrogenase dua sampai tujuh kali lebih besar dalam keratinosit infrainfundibulum dibandingkan pada epidermis bagian tubuh lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa anomali metabolisme androgen dalam keratinosit infrainfundibulum dapat mengakibatkan anomali proliferasi dan diferensiasi sel-sel tersebut. Fenomena hormon lokal juga berperan dalam pembentukan komedo-mikro.(Pawin, 2004)

Peran sitokin, secara in vitro penambahan interleukin-la    (IL-la) dalam medium kultur yang mengandung kanalis pilosebasea mengakibatkan pembentukan komedo mikro. IL‑la ini memodulasi kornifikasi epidermis dan diduga terlibat pada proses inflamasi yang menginduksi komedo. IL-la disekresi oleh keratinosit dalam epidermis dan infrainfundibulum yang ditemukan dalam reaksi terhadap iritasi lokal.(Pawin et.al., 2004, Webster, 2007)

Hiperploriferasi keratinosit, Hiperproliferasi lapisan keratinosit pada dinding folikel dan reduksi deskuamasi oleh peningkatan kohesi keratinosit yang menyebabkan terjadinya akumulasi keratinosit dalam folikel selama komedogenesis akan meningkatkan aktivasi TNF-a, IL-la. (Baz et.al., 2008, Sidiropoulos, 2006) Secara ex vivo, keratinosit kanalis pilosebasea pada seseorang yang berjerawat memiliki indeks proliferasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol yang sehat. (Pawin, 2004)

Peran molekul adhesif, Integrin merupakan molekul adhesif yang memungkinkan terjadinya kohesi antar keratinosit. Tugasnya mengatur proliferasi dan migrasi keratinosit. Penelitian terbaru membuktikan modifikasi ekspresi integrin a2, a3, a5 dalam keratinosit infrainfundibulum folikel akne. Perubahan ekspresi ini juga berperan dalam pembentukan komedo mikro.

Peran komposisi sebum, Hiperseborrhea mengurangi konsentrasi asam linoleat dalam sebum melalui dilusi. Kandungan asam linoleat yang rendah ini menginduksi kelainan diferensiasi keratinosit dalam infrainfundibulum yang mempengaruhi pembentukan komedo mikro.(Pawin et.al., 2004)

Dengan demikian pembentukan komedo mikro sebagai lesi awal AV dapat disebabkan oleh beberapa kelainan dalam infrainfundibular keratinosit dan lingkungannya yang memproduksi IL-la, ekspresi integrin keratinosit yang abnormal, kelainan metabolisme infra keratinosit androgen dan kelainan komposisi sebum.(Pawin et.al., 2004)

  1. c. Tahap ketiga : Pembentukan lesi inflamasi

Super antigen P.acnes, super antigen mengaktivasi sel-sel secara langsung, tidak dipengaruhi oleh aktivitas sel antigen, yang mengaktivasi efektor sel dengan cepat dan ekstensif. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa sebagian fraksi membran P.acnes terkadang berperan sebagai super antigen yang memperkuat reaksi inflamasi dengan mengaktifkan keratinosit dan melepaskan sitokin inflamasi secara in situ.(Pawin, 2004)

Peran sitokin, sitokin ialah molekul kecil polipeptida yang berfungsi sebagai molekul messenger, penghantar komunikasi antar sel yang terlibat di dalam proses imunologik dan radang. Sekelompok protein yang digolongkan sebagai sitokin yaitu: limfokin, monokin, interleukin, interferon, tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) dan faktor pertumbuhan seperti transforming growth factor-alpha (TGF-a).(Baratawidjaja, 2006)

Penelitian invitro terbaru. yang difokuskan pada infrainfundulum, menunjukkan bahwa sitokin berperan dalam siklus lesi AV. Dalam fase pertama IL-la mendukung pembentukan komedo TGF mengakibatkan ruptur komedo dan interferon gamma dan    TNF-a difusi reaksi inflamasi. Dalam fase kedua sitokin-sitokin tersebut menghambat produksi sebum melalui diferensiasi epitelial sebocyte yang menjelaskan regresi spontan lesi akne. (Pawin et.al., 2004)

Respon inflamasi terhadap TNF-a dimediasi secara langsung dan melalui stimulasi ekspresi daripada IL-1 dan sitokin proinflamasi lainnya. Nampaknya TNF-a memegang peranan penting pada patogenesis AV, faktor yang mempengaruhi produksinya kemungkinan terlibat pada derajat respon inflamasi dan oleh karena itu berperan pada tingkat beratnya gambaran klinis AV.(Baz et.al., 2008)

Banyak sitokin yang terlibat dalam proses inflamasi yang terjadi pada akne vulgaris. Interleukin-la, interferon-c, TGF-α dan interleukin-4 merupakan empat bagian penting dalam proses ini, secara paradoksikal mengontrol terbentuknya akne dan regresi spontan lesi akne. Sitokin-sitokin ini disekresi oleh oleh keratinosit yang aktif, menginduksi terbentuknya komedo, dan menstimulasi sistem imun non spesifik. TNF-a, interleukin-6 dan interleukin-8 juga disekresi oleh keratinosit, yang memperkuat reaksi inflamasi di folikel pilosebasea dan kemotaksis netrofil PMN. Disamping itu P. acnes sendiri juga memperkuat reaksi inflamasi yang muncul dengan cara mensekresi faktor-faktor yang menyerupai IL-1a, IL-8 dan TNF-a.

Penelitian invitro terbaru, target pada infundibulurn, menunjukkan peranan penting sitokin pada siklus akne. Pada fase awal, IL-Iα mendorong terbentuknya komedo, rupturnya komedo oleh TGF, dan difusi reaksi inflamasi oleh IL-g dan TNF-a. pada fase kedua sitokin ini menghambat produksi sebum melalui diferensiasi epitel sebosit menjelaskan regresi spontan yang terjadi pada akne.

Faktor Genetika

Akne sering terjadi pada anggota keluarga. dimana tingkat beratnya akne vulgaris juga dipengaruhi oleh genetik, ditemukan pada anggota keluarga yang sama. Meskipun penyakit ini diketahui sebagai penyakit bawaan, data mengenai peranan genetik sebagai pendukung hal ini masih relatif terbatas. Keterlibatan faktor genetik pada patogenesis AV dapat terlihat pada saudara kembar dan telah dibuktikan. Pada tipe akne tertentu, seperti akne konglobata, faktor herediter sangat jelas berperan dan berhubungan dengan akne neonatal dan keluarga hiperandrogenisme.(Baz et.al., 2008, Maria I.Herane., 2003)

Penelitian tentang adanya peranan faktor genetik pada akne telah dibuktikan jauh sebelumnya oleh Hecht pada tahun 1960. Menurutnya jika salah satu dari orangtua menderita akne pada masa mudanya, maka anaknya memiliki kemungkinan 80% untuk mengalami hal serupa. Beberapa penelitian selanjutnya yang dilakukan pada kembar mendukung hipotesis ini. Penelitian pada 95 pasangan kembar yang menderita akne memperlihatkan bahwa 98% terdiri dari pasangan kembar yang identik lebih dipengaruhi dibandingkan pada kembar dizigotik hanya berkisar 46%. Dua penelitian lainnya mendukung teori ini bahwa hasil yang signifikan diperoleh pada kembar monozigot & bandingkan kembar dizigot. Penelitian lebih lanjut yang dilakukan di Perancis tahun 1996 pada 913 anak Sekolah Dasar dengan batas usia 11-18 tahun dan menggunakan mode cross sectional memperlihatkan bahwa 16% dari anak memiliki riwayat ayah menderita AV dan 25% dari anak mempunyai riwayat ibu yang menderita AV. Proporsi untuk anak tanpa AV rendah yaitu 8% dan 14%. Hasil ini bertendensi mendukung teori bahwa faktor genetik berperan signifikan pada akne.(Ballanger et.al., 2006)

Salah satu penelitian terbaru telah menunjukkan bukti adanya dominasi alel gen sitokrom p450 pada pasien AV. Mutasi ini berperan dalam hal degradasi cepat retinoid alami yang mengakibatkan gangguan diferensiasi keratinosit dan hiperkeratinisasi kanalis folikel pilosebasea akibat obstruksi. Data terbaru lainnya yang diperoleh menunjukkan adanya modifikasi struktural reseptor androgen yang berasal dari genetik kemungkinan disebabkan oleh modifikasi respon perifer terhadap androgen.(Pawin et.al., 2004)

Faktor-faktor lain

Saat ini berbagai penelitian terus dilakukan untuk memahami mekanisme AV secara detail. Terdapat beberapa pandangan mengenai faktor-faktor sebagai pencetus AV.

Di daerah yang mempunyai empat musim, biasanya akne bertambah hebat pada musim dingin, sebaliknya biasa membaik pada musim panas. Menurut Cunfille, pada musim panas didapatkan 60% perbaikan akne, 20% tidak ada perubahan dan 20% bertambah hebat. Bertambahnya AV pada, musim panas bukan disebabkan oleh sinar ultraviolet melainkan oleh banyaknya keringat pada keadaan yang sangat lembab dan panas. (Pawin et.al., 2004)

Schafer dkk meneliti pada 896 orang pada batas umur 1-87 tahun pada penelitian cross-sectional mendapatkan prevalensi akne sekitar 26.8%. Prevalensi akne signifikan meningkat pada perokok aktif bila dibandingkan dengan bukan perokok(40.8% vs. 25.2%, odds ratio: 2.04, 95% confidence interval: 1.40-2.99). Penelitian ini memiliki batas umur yang luas dan jika dibandingkan dengan penelitian Firooz dkk(2005) dengan batas umur (15-40 tahun) didapatkan, tidak terdapat hubungan antara akne dan merokok (54/102 perokok dibandingkan dengan 93/184 bukan perokok yang memiliki akne, odds ratio : 1.10, 95% confidence interval: 0.68-1.79, p > 0.05). Jemec dkk pada penelitiannya dengan pengambilan sampel random dari 186 orang dengan batas umur 15-22 tahun mendapatkan prevalensi akne dan kebiasaan merokok sekitar 40.7% laki-laki dan 23.8% wanita menderita akne tetapi merokok tidak signifikan berhubungan dengan akne.(odds ratio: 0.54, 95% confidence interval: 0.17-1.78). (Alireza Firooz, 2005)

  1. 4. Gambaran Klinis

Akne vulgaris merupakan penyakit dari unit pilosebasea yang dapat sembuh sendiri dan terutama mengenai remaja. Predileksi akne vulgaris terutama pada wajah, punggung, dada, dan bahu. Pada badan lesi cenderung terdapat disekitar garis tengah tubuh. Lesi AV dapat bersifat inflamasi maupun noniflamasi. Lesi non-inflamasi termasuk komedo, yang dapat berbentuk komedo terbuka (blackhead) dan komedo tertutup (whitehead). Lesi yang bersifat inflamasi bervariasi mulai dari papul kecil dengan batas merah hingga pustul yang dapat menjadi lebih besar.(Zaenglein et.al., 2008)

Akne vulgaris dapat juga diklasifikasi berdasarkan tipe lesi yaitu komedonal, papulopustular dan nodulokistik. Pustul dan kistik dapat dipertimbangkan sebagai AV inflamasi.(Feldman et.al., 2004) Lesi inflamasi yang lebih dalam biasanya berhubungan dengan jaringan parut, tetapi jaringan parut juga dapat terjadi pada lesi yang superfisial. Beberapa varian dalam AV antara lain, akne konglobata, akne fulminant, akne excoriee, akne mekanik dan akne infantil.(Zaenglein et.al., 2008, Gawkrodger, 2003, Simpson dan Cunliffe, 2007)

Jika terjadi pembentukan sinus diantara beberapa nodul maka akan menyebabkan efek kosmetik yang kurang bagus. Pada AV gatal sangat jarang terjadi, biasanya muncul pada awal terapi dan diduga berhubungan dengan pelepasan mediator histamin dari P.acnes.(Simpson, 2007)

  1. 5. Klasifikasi

Beberapa klasifikasi tingkat keparahan akne dikemukakan untuk mengevaluasi pengobatan akne.

Klasifikasi AV berdasarkan Combined Acne Severity Classification adalah (Lehmann et.al., 2002) :

  1. Akne vulgaris ringan bila jumlah komedo < 20, atau lesi inflamasi < 15 atau lesi total berjumlah < 30 buah.
  2. Akne vulgaris sedang bila jumlah komedo 20 – 100, atau lesi inflamasi 15 – 50 atau lesi total berjumlah 30 – 125 buah.
  3. Akne vulgaris berat bila : jumlah komedo > 100, atau lesi inflamasi > 50, atau jumlah lesi total > 125 buah, atau kista berjumlah > 5.

 

  1. B. LATAR BELAKANG GENETIKA PADA AKNE VULGARIS

Gen-gen yang terkait akne vulgaris berupa gen sitokrom P4501A1 manusia (CYP1A1), gen steroid 21-hidroksilase (CYP21), gen mucin epithelium (MUC1) atau reseptor androgen, gen sitokrom P450C17 (CYP17) dan gen TNF-a -308 G/A. Penulisan letak gen pada kromosom diatur, seperti gen TNF-a terletak pada kromosom 6 (6p21.3) yang berarti materi pembawa genetik untuk molekul permukaan Gen TNF-a terletak pada lokus 21.3. (Yuwono.T, 2002, Webster, 2007)

  1. 1. Kromosom dan Nomenklaturnya

Bahan genetik manusia terletak di dalam inti sel (nukleus) dan dikemas sedemikian rupa membentuk struktur yang disebut kromosom. Struktur kromosom dapat dibedakan menjadi : (1) lengan kromosom, (2) sentromer dan (3) telomer. Lengan kromosom terdiri atas dua bagian yaitu p arm (petite arm, lengan pendek) dan q arm Long arm, lengan panjang). Lengan kromosom adalah bagian kromosom yang mengandung rangkaian gen, sentromer adalah bagian tengah kromosom yang berfungsi alam proses distribusi kromosom pada waktu terjadi pembelahan sel, sedangkan telomer adalah bagian ujung kromosom. Kromosom sel manusia mempunyai 46 kromosom atau 3 pasang kromosom (diploid) mencakup 44 (22 pasang) kromosom autosomal dan 2 (1 pasang) kromosom seks. Manusia mempunyai sistem penentuan sex XY, dengan pengaturan kromosom sex XX pada perempuan dan kromosom sex XY pada laki-­laki.(Yuwono.T, 2002)

 

  1. 2. Polimorfisme Promoter Gen TNF-α -308

Sitokin dikeluarkan selama tahapan efektor dari imunitas bawaan dan imunitas yang didapat melalui berbagai sel dan jaringan. Meskipun sitokin bereaksi pada konsentrasi yang sangat rendah (pg/ml), efeknya sangat berhubungan dengan tingkat sirkulasinya. Sehingga, deregulasi dari ekspresi gen yang meningkatkan produksi sitokin dapat mengubah homeostasis sebuah organisme, yang mengakibatkan kegagalan organ spesifik atau bahkan kegagalan sistemik. Ketidakseimbangan sitokin berperan dalam patogenesis dari patogen penyakit infeksi yang berbeda dan penyakit inflamasi. TNF bersama sitokin lainnya, telah dijelaskan mempunyai peranan utama didalam proses ini.(Jimena Cuenca, 2001, Ifor R.Williams, 2008)

TNF merupakan suatu kelompok protein yang terdiri atas limfotoksin a (Lta) dan limfotoksin b (ltb). Meskipun sel T dapat memproduksi TNF, monosit yang teraktivasi dan makrofag merupakan sumber utama TNF, yang disintesis sebagai pro protein 20kDa dan dibelah oleh TNF, mengubah enzim menjadi monomer 17kDa. Dibawah kondisi fisiologis, TNF bersirkulasi sebagai homotrimer stabil berbentuk kerucut yang memediasi efeknya dengan mengikat dua molekul reseptor, TNFRI (p55) dan TNFRII (p75). TNFRI dianggap sebagai jalur dominan dan. telah diimplikasikan dalam sebagian besar efek TNF diketahui, termasuk induksi pada aktivitas makrofag, upregulasi dari molekul, kohesi, dan aktivasi nuclear factor kB.(Ifor R.Williams, 2008, Jimena Cuenca, 2001)

Pada pertengahan 1980-an, protein TNF telah dimurnikan dan gennya telah Inning, dirangkaikan, dan dipetakan pada Major Hystocompatibility Complex (MHC) regio klas III pada lengan pendek kromosom 6. Gen TNF kedua-duanya disusun dengan a dan Ltb didalam lokus TNF, sebuah regio 7kb sentromerik 250kb hingga pada lokus HLA B, telomerik 400 kb hingga ke lokus C2/13F dan 1000kb dari klas MHC II gen DR. (Jimena Cuenca, 2001)

Tumor Necrosis Factor telah dihubungkan dengan efek biologi spektrum luas, dan merupakan faktor pertama yang terlibat dalam arus sitokin yang meningkatkan inflamasi dan berguna dalam mengaktifkan makrofag pada pertahanan host terhadap mikroba yang menginvasi selama terjadinya infeksi. Sehingga TNF dapat memediasi baik efek menguntungkan dan efek merugikan tergantung pada keadaan proses penyakitnya. Tumor Necrosis Factor kini diketahui terlibat dalam merangsang produksi sitokin, meningkatkan ekspresi molekul adhesi dan aktivasi netrofil. juga merupakan stimulator tambahan untuk aktivasi sel T dan produksi antibodi oleh sel B. (Jimena Cuenca, 2001, Baz et.al., 2008)

Meskipun tingkat sirkulasi level TNF sangat bervariasi, upregulasi dari ekspresi gen telah dilibatkan dalam patogenesis berbagai jenis penyakit dengan komponen inflamasi, autoimun, proses infeksi akut dan kronis. (Jimena Cuenca, 2001)

Produksi TNF bisa diatur pada tingkatan transkripsi, pasca transkripsi, dan tingkat translasional. Dikatakan juga bahwa keragaman pada promoter dan daerah pengkodean pada gen TNF bisa mengatur besarnya respon sekretori dari sitokin ini. Polimorfisme di dalam gen TNF bisa mempengaruhi regulasi transkripsional, karena tingkat sekresi dari TNF oleh monosit manusia dan sel mononuklear darah perifer secara invitro berhubungan dengan perluasan halotip HLA dan alel mikrosatelit yang berhubungan dengan TNF pada regio klas III MHC. Beberapa polimorfisme nukleotida tunggal telah teridentifikasi didalam promoter gen TNF manusia. Paling penting yaitu yang telah teridentifikasi pada posisi -308 (TNF-a -308), yang melibatkan penggantian guanin (G) untuk adenin (A). Secara invitro TNF-a -308 alel A memperlihatkan aktivasi trankripsi yang kuat dibandingkan TNFa–308 alel G. Beberapa penelitian juga memperlihatkan peningkatan produksi TNF-a yang berhubungan dengan TNF-a -308 alel A. Terdapat peningkatan produksi TNF-a pada pasien dengan TNF-a-308 G/A heterozigot. Selanjutnya dikatakan pula bahwa ekspresi TNF-a bergantung pada polimorfisme promoter TNF-a atau berhubungan dengan genotif HLA. Hal ini juga dihubungkan dengan peningkatan kerentanan terhadap berbagai penyakit, salah satunya adalah akne vulgaris.(Jimena Cuenca, 2001, Baz et.al., 2008)

 

  1. C. STRUKTUR DEOXYRIBO NUCLEIC ACID (DNA)

Struktur molekul DNA pertama kali diungkapkan oleh James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data kimia dan fisika, Watson dan Crick membuat model struktur DNA yang disebut untai-ganda (double helix). Untai ­Ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Struktur semacam ini disebut sebagai struktur untai putar-kanan (right-handed helix). Jika seorang pengamat melihat DNA semacam ini ke arah bawah aksisnya, maka masing-masing rantai terlihat memutar sesuai dengan arah putaran jarum jam dan menjauh dari si pengamat. Dalam kondisi fisiologis, DNA mempunyai struktur untai putar kanan yang setiap putarannya ada 10 basa DNA. Meskipun demikian, studi menunjukkan bahwa banyaknya basa DNA tiap putaran ternyata bervariasi. Perubahan pada struktur DNA dalam keadaan invivo berkaitan erat dengan proses fisiologis yang berlangsung pada sel. Sebagai contoh, pada waktu sel membelah terjadi proses replikasi DNA. Replikasi DNA dapat dimulai setelah ada perubahan pada struktur DNA yaitu berupa terlepasnya ikatan hidrogen yang membentuk struktur untai-ganda. (Yuwono.T, 2002)

Sebagai pembawa materi genetik, kromosom terdiri dari molekul deoxyribonucleic acid (DNA) yang mengandung informasi genetika yang diwariskan turun temurun dari satu generasi ke generasi berikutnya; informasi ini ditentukan oleh urutan pasangan basa pada DNA.

Informasi ini dikode di dalam substansi kimiawi DNA
dan diproduksi dalam semua sel tubuh. Program inilah yang mengendalikan perkembangan sifat biokimiawi, fisiologi dan sebagian sifat perilaku. (Suryo, 1998,Campbellet et.al., 2002)

Molekul DNA merupakan rantai ganda yang panjang, dengan basa-basa komplementer (A-T; G-C) berpasangan menggunakan ikatan hidrogen pada pusat molekul. Sifat komplementer dari basa memungkinkan satu rantai cetakan (template) menyediakan informasi untuk salinan atau ekspresi informasi pada suatu rantai yang lain (rantai penyandi). Pasangan-pasangan basa ini tersusun dalam bagian pusat double helix DNA, dan menentukan informasi genetiknya.(Yuwono.T, 2002)

Setiap untai heliks DNA tersusun oleh sederetan nukleotida-nukleotida yang menjadi unit dasar dari DNA yang biasanya disebut deoxynucleotide. Sebelum disintesis menjadi DNA, molekul nukleotida berada dalam keadaan bebas terapung-apung dalam protoplasma sel. Dalam keadaan ini nukleotida berbentuk trifosfat. Setiap nukleotida dibentuk dari tiga macam molekul yaitu : (Suryo, 1998, Pelczar, 1998)

  1. Gula. Sebuah gugusan gula yang berkarbon lima (pentosa) yang biasa disebut deoksiribosa.
  2. Sebuah molekul asam fosfat.
  3. Basa, nitrogen.

Deoxyribonucleic acid (DNA) double helix dapat dikopi secara persis karena masing-masing untai mengandung sekuen nukleotida yang persis berkomplemen dengan sekuen untai pasangannya. Masing-masing untai dapat berperan sebagai cetakan untuk sintesis dari untai komplemen barn yang identik dengan pasangan awalnya.(Campbell, 2002)

 

 

 

 

 

 

  1. D. EKSTRAKSI DNA

Isolasi DNA merupakan proses mengidentifikasi DNA dari suatu makhluk hidup dengan suatu proses ekstraksi DNA di dalam sel. Tujuan isolasi DNA adalah untuk memisahkan genom DNA dari molekul lain di dalam suatu sel. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah dan komponen darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, yang merupakan tempat DNA. Banyak metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung pada specimen yang akan diekstraksi. Metode tersebut pada dasarnya memiliki prinsip yang sama, namun ada beberapa modifikasi yang biasa digunakan untuk dapat menghancurkan inhibitor yang ada dalam masing-masing cumber spesimen.(Hatta, 2002)

Salah satu tehnik yang dapat digunakan untuk ekstraksi DNA adalah QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN) yang merupakan tehnik cepat dan mudah untuk purifikasi total DNA akurat sebelum melakukan PCR. Prosedur pengosongan dan pemutaran QIAamp, merupakan metode ideal untuk proses yang simultan dari banyak sampel, yang menghasilkan DNA murni siap untuk diamplifikasi secara langsung hanya dalam waktu 20 menit. Prosedur pemutaran QIAamp sepenuhnya dapat terjadi secara otomatis pada QIAcube@ sehingga memudahkan dalam penggunaannya. Prosedur QIAamp dapat digunakan bersama darah lengkap segar atau darah lengkap beku dan darah yang telah diberi sitrat, heparin, atau EDTA. Pemisahan leukosit terlebih dahulu tidak perlu dilakukan. Purifikasinya tidak memerlukan ekstraksi fenol/kloroform atau presipitasi alkohol. DNA murni yang dihasilkan adalah bebas dari protein, inti-inti sel dan kontaminan atau inhibitor lainnya.(Group, 2007)

 

 

 

  1. E. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA suatu skuens primer oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan dan berasal dari spesimen klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel pada ujung 3′ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium menstimulasi aktivasi polimerase. (Yuwono, 2006)

Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama yaitu (Yuwono, 2006) :

  1. DNA cetakan. Adalah fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul. Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.
  2. Oligonukleotida primer. Adalah suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 – 28 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60%.
  3. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP). Terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi polimerasi.
  4. Enzim DNA Polimerase. Adalah enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA.
  5. e. Senyawa buffer.

Pada proses PCR menggunakan alat termosiklus, sebuah mesin yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat yaitu : (Yuwono; 2006)

  1. 1) Denaturasi

Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polimerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5, 95 dan 97,5°C.

  1. 2) Annealing (penempelan primer)

Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36°C sampai dengan 72°C, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60°C.

  1. 3) Pemanjangan Primer (Extention)

Selama tahap ini Taq polimerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3′. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72°C diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih clad cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda.

 

Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi.

Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas memasukkan DNA ke dalam gel agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil pindah dengan cepat dan untai yang besar diantara gel menunjukkan hasil positif (Yuwono, 2006).

Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas PCR terletak pada kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk melalui sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi karena DNA polimerase mampu menghindari kesalahan pada amplifikasi produk. Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi. (Yuwono, 2006)

 

  1. F. LANDASAN TEORI

Berdasarkan tinjauan pustaka tersebut diatas, pokok-pokok pikiran yang dijadikan landasan untuk menilai polimorfisme promoter gen TNF-α     -308 pada penderita akne adalah sebagai berikut:

1.  Salah satu patogenesis akne vulgaris yang diduga sangat berperan adalah proses inflamasi yang terjadi pada individu yang memiliki kerentanan genetik.

2.  Perkembangan manifestasi klinis AV membutuhkan interaksi antara predisposisi secara genetik terhadap penyakit dan faktor pencetus lingkungan balk lokal maupun sistemik.

3.  Polimorfisme promoter gen TNF-α -308 mempengaruhi regulasi sistem imunitas untuk produksi sitokin proinflamasi pada AV.

4.  Polimorfisme promoter gen TNF-α -308 diidentifikasi menggunakan teknik PCR­-sequencing.

 

 

  1. G. KERANGKA TEORI

 

 

Lingkungan

–   Musim

–   Trauma

–   Merokok

–   Alkohol

 

 

Akne vulgaris

ringan

 

INFLAMASI

–   sitoksin proinflamasi

–   IL-1a­,TNFa­, HLA-DR ­,infiltrate CD4>CD8

–   Aktivasi makrofag IL-b­,TNFa­,

–   Penarikan neutrofil & leukosit

–   Aktivasi Komplemen

–   superantigen

 

 

 

Stress

 

 

Diet

 

 

Hiperkeratinisasi folikel

 

 

Hiperproduksi

Kel. sebasea

 

 

Genetik

 

 

Hormon

 

 

Mikro komedo

 

 

Mikroorganisme P.acnes ­


  1. H. KERANGKA KONSEP

 

Trauma

 

Akne ringan

 

musim

 

P.acnes­

 

Kerusakan

Keratinosit

 

 

Genetik (Polimorfisme promoter gen

TNF-a-308)

 

Proses inflamasi


 

 

 

 

 

 

Keterangan :

 

 

:   v. bebas                                                         :   v. moderator

 

 

:   v. antara                                                        :   v. kendali

:   v. tergantung


BAB. III

METODE PENELITIAN

  1. A. DESAIN

Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksploratif dengan analisis menggunakan pendekatan case control study

  1. B. TEMPAT DAN WAKTU

Penelitian dilakukan di Poliklinik Kulit dan Kelamin RS Dr. Wahidin Sudirohusodo dan Laboratorium FK-UNHAS Makassar, mulai bulan    Maret-Mei 2011.

 

  1. C. POPULASI DAN SAMPEL
    1. 1. Populasi Penelitian

Kasus: Diambil dari kelompok penderita Akne vulgaris ringan yang datang ke Poliklinik Kulit dan Kelamin RSUP Wahidin Sudirohusodo dan jejaringnya.

Kontrol: Diambil dari kelompok individu sehat dengan jumlah dan rentang umur yang hampir sama dengan kasus.

 

  1. 2. Sampel Penelitian

Kriteria inklusi (kasus)

  1. Pasien AV ringan berdasarkan kriteria Lehmann (2002)
  2. Pasien menyetujui dan menandatangani formulir informed consent.
  3. Tidak menggunakan anti inflamasi dan antibiotik (dalam 2 minggu terakhir).
  4. Tidak sedang menderita infeksi kronis kulit lainnya berdasarkan anamnesis.

Kriteria ekslusi (kasus)

Subyek menolak berpartisipasi

Kriteria Inklusi (kontrol)

  1. Individu sehat dengan rentang umur hampir sama kasus
  2. Menyetujui dan menandatangani formulir informed content.

  1. 3. Cara PemilihanSampel

–          Pemilihan sampel kasus secara Consecutive Sampling

–          Pemilihan sampel kontrol secara Consecutive Sampling

  1. 4. Perkiraan Besar Sampel:

Penentuan besar sampel kasus berdasarkan tabel Mann Whitney, dengan jumlah sampel 21 orang sedangkan kontrol 20 orang.

 

  1. D. ALAT DAN BAHAN PENELITIAN
  2. 1. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian, ini yaitu: ethanol (96-100%), pipet mikrosentrifus 1,5 ml, pipet tip dengan aerosol barrier, mikrosentrifus (dengan rotor tube 2mi), vortexer, waterbath/heating block dengan suhu 56°C, larutan buffer fosfat Oika diperlukan) dan sarung Langan.

 

  1. 2. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu: sampel darah penderita. AV ringan dan orang sehat, larutan bufer AW1, AW2, AL, AE, proteinase-K solution, primer gen TNF-α -308 yang secara spesifik akan mengamp!ifikasi target sebagai berikut:

Primer Forward: 5 AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3

Primer Reverse : 5 -TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3

 

  1. E. CARA KERJA
    1. 1. Pencatatan

Wawancara (anamnesis) :

Pasien yang datang berobat ke poli kulit dan kelamin RS. Wahidin Sudirohusodo dan jejaringnya, dilakukan anamnesis dan pemeriksaan fisik untuk menegakkan diagnosis.

 

  1. 2. Prosedur

Pasien yang bersedia untuk menjadi sampel dalam penelitian ini, lalu mengisi Surat pernyataan persetujuan dengan menggunakan Informed consent.

Sampel dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok Akne vulgaris ringan dan kelompok kontrol.

  1. 3. Pengambilan sampel

Sampel darah vena pasien akne vulgaris ringan dan kontrol diambil dengan menggunakan spuit 3 cc yang kemudian disimpan dalam tabung EDTA sebanyak ± 1 cc darah

  1. 4. Ekstraksi DNA dengan metode QIAamp®DNA mini (Group, 2007)

Ekstraksi DNA dilakukan dengan cara sebagai berikut :

  1. Dengan menggunakan pipet, proteinase-K diambil sebanyak 20 gl dicampur kedalam microsentrifus tube.
  2. Tambahkan kedalam mikrosentrifus tube sampel darah 200µl.
  3. Tambahkan 200pi Bufer AL ke dalam sampel, kemudian dicampur dengan menggunakan vortex secara teratur selama 15 detik.
  4. Diinkubasi pada suhu 56°C selama 10 menit
  5. e. Tambahkan 200gl ethanol 96% pada sampel, dan campur lagi dengan menggunakan vortex selama 15 detik. Setelah tercampur, sentrifus singkat mikrosentrifus tube tersebut
  6. Dengan hati-hati masukkan hasil campuran (tahap e) ke QIAamp mini spin column, tutup penutupnya, dan sentrifus pada kecepatan 6000 x 9 (800Orpm) selama 1 menit. Simpan QIAamp mini spin column pada tube 2ml yang bersih (disiapkan) dan sisihkan tube yang berisi filtrat.
  7. Kemudian buka secara hati-hati QIAamp mini spin column dan masukkan 500RI buffer AWI,tutup penutupnya dan sentrifus pada kecepatan 6000 x 9 (800Orpm) selama 1 menit. Simpan QIAamp mini spin column pada tube 2ml yang bersih (telah disiapkan) dan sisihkan tube yang berisi filtrat.
  8. Buka dengan hati-hati QIAamp mini spin column dan tambahkan 500md Bufer AW2, tutup penutupnya dan sentrifus dengan kecepatan penuh (20,000 x 9; 14,000 rpm) selama 3 menit.
  9. Dianjurkan ; Simpan QIAamp mini spin column pada 2ml koleksi tube yang bare (cadangan) dan sisihkan koleksi tube tadi dengan filtrate. Sentrifus dengan kecepatan penuh selama 1 menit.
  10. Simpan QIAamp mini spin column pada mikrosentrifus tube 1,5ml yang telah disiapkan, dan sisihkan koleksi tube yang berisi filtrat. Buka dengan hati-hati QIAamp mini spin column dan tambahkan 200ml bufer AE atau air siding. Inkubasi pada suhu ruangan (15-25°C) selama 1 menit dan kemudian sentrifus pada 600 x (800Orpm) selama 1 menit. Siap untuk di PCR.
  11. 5. Polymerase Chain Reaction (PCR)

–          Tahap pemeriksaan PCR sebagai berikut:

DNA yang didapat dari hasil ekstraksi akan di amplifikasi dengan PCR sesuai format PCR mix yang telah ada atau dibuat sesuai kondisi susunan primer TNF-a-308, sebagai berikut: produk PCR/ super mix sebanyak 22,5 ul ditambah dengan primer Forward (40 pM) 0,5 ul dan primer Reverse (40 pM) 0,5 ul Berta sampel/template DNA 1,5 ul, sehingga jumlah keseluruhan PCR mix menjadi 25 ul.

–          PCR mix dimasukkan ke dalam mesin PCR

–          Hasil PCR siap di running di agarose gel 2-2.5% (NuSieve GTG Agarose , etc)

  1. 6. Elektroforesis
    1. Buat Gel
      1. Timbang 200 gr agarose dan dilarutkan dalam 100 ml TBE buffer lx untuk mendapatkan larutan agarose 2%.
      2. Campuran agarose dan TBE buffer lx dipanaskan hingga larut kemudian ditunggu hingga agak dingin kemudian ditambah 15 ul SybrSafe.
      3. Larutan agarose dituang ke dalam cetakan dan ditunggu hingga beku.
      4. Pembuatan DNA marker
        1. Sebanyak 25 ul DNA 100 bp ladder dimasukkan ke dalam tube berisi 1 ml Blue juice loading dye, dan dicampur untuk membuat marker.
        2. Laber tube dicopot dan diganti menjadi marker.
        3. Persiapan Running Elektroforesis
          1. Gel yang telah beku dimasukkan ke dalam elektroforesis dan direndam dalam larutan TBE lx.
          2. 10 ul amplicon hasil PCR ditambah dengan 1-1 V2 ul Blue juice loading dye (tanpa marker), dicampur dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel sebanyak 15 ul.
          3. Marker dimasukkan ke dalam sumur didekat kontrol positif.
          4. Running Elektroforesis
            1. Elektroforesis dihidupkan dan dijalankan dari muatan negatif (katoda) ke muatan positif (anoda) pada 100 A dan 40 menit.
            2. Setelah elektroforesis dilihat pica yang terbentuk. Apabila pica sejajar dengan kontrol positif berarti hasil positif.
          5. 7. Sequencing
            1. Band yang terlihat di UV light dipotong dan dimasukkan dalam effendorf 1.5 ml. kemudian dilakukan proses purifikasi dengan kit (QIAquick PCR purification kit) dengan protokol sebagai berikut:
              1. Tambahkan buffer QG sebanyak 300 ul
              2. Panaskan dgn heat block selama 10 menit pada suhu 50°C
              3. Tambahkan isopropanol (2-propanol) sebanyak 100 ul
              4. Pindahkan ke tabung QIAquick spin column
                1. Sentrifus selama 1 menit, 12.000 rpm suhu kamar, buang dan kemudian tambahkan buffer PE 750 ul, kmd centrifuge lagi 1 menit 12.000 rpm dan buang.
                2. Sentrifus lagi 1 menit 12.000 rpm, keringkan
                3. Tambahkan buffer ER 25 ul (ganti dgn effendorf 1.5 ul. Diamkan selama 2 menit kmd sentrifus 10.000 rpm selama 1 menit
                4. Hasilnya siap untuk dilakukan sequencing.
              5. PCR sequencing, dengan :

Primer (F or R) 1 pmol         : 3.2 ul

DNA purification                  : 2-5 ul

Big dye        :  4 ul

Buffer          :  4 ul

DW              :  tambahkan sampai 20 ul

Total            :  20 ul

  1. Running di PCR mesin dengan format:

96°C            :  3 menit

96°C            :  10 detik

50°C            :  5 detik

60°C            :  4 detik           selama 25 siklus

  1. Hasilnya dilakukan presipitasi sebelum dimasukkan dalam mesin sequencing. Cara presipitasi yaitu:
    1. Tambahkan 2 ul 3 M Sodium Acetat
    2. Tambahkan 50 ul alkohol 100% (dingin)
    3. Inkubasi selama 5 menit 4°C
    4. Sentrifus selama 20 menit, 15.000 rpm
    5. Supernatan di buang
    6. Tambahkan etanol 70°C (dingin) sebanyak 100 ul
    7. Sentrifus selama 5 menit 13.000 rpm, kemudian supenatan dibuang
    8. Keringkan selama 10 menit
    9. Tambahkan H di formamide 25 ul (pengganti TSR)
    10. Denaturasi dengan panas 95°C heating block selama 3 menit kemudian langsung dipindahkan ke ice box selama 5 menit (effendorf 1,5 ml)
    11. Bisa disimpan di-20ºC atau langsung ke mesin sequencing untuk running.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. F.

     

    Subyek

    ALUR PENELITIAN

 


 

 

Inklusi dan Ekslusi sampling

s

 

Akne vugaris ringan

 

Specimen darah

 

PCR sequencing

 

 

Polimorfisme promoter gen TNFa-308

 

Kontrol

 

Specimen darah

 

PCR sequencing

 

 

Polimorfisme promoter gen TNFa-308

 

 

Uji statistik sesuai dengan tujuan (rasio odd)


G. VARIABEL PENELITIAN

–          Variabel tergantung                 : Akne vulgaris ringan

Skala                          : Ordinal

–          Variabel bebas                       : Polimorfisme Promoter Gen TNF-α -308

Skala                          : Nominal

 

H. IDENTIFIKASI VARIABEL

  1. Variabel bebas              :   Polimorfisme Promoter Gen TNF-α -308
  2. Variabel tergantung        :   Akne vulgaris ringan
  3. Variabel antara               :   Proses inflamasi
  4. Variabel moderator        :   P Acnes, kerusakan keratinosit
  5. Variabel kendali             :   trauma dan musim

 

  1. I. DEFINISI OPERASIONAL
    1. Polimorfisme Promoter Gen TNF-α -308 adalah munculnya lebih dari satu kondisi genotip pada posisi gen promotor TNF-a -308 dengan subsitusi Guanin ke Adenin yang diamati dengan menggunakan PCR-Sequencing.
    2. Pasien akne vulgaris ringan adalah pasien yang didiagnosis akne vulgaris dengan jumlah komedo< 20, atau lesi inflamasi <15, atau jumlah lesi total < 30 buah.
    3. Pasien Kontrol adalah orang sehat, berdasarkan anamnesis dan pemeriksaan tidak memiliki lesi akne vulgaris dan penyakit inflamasi kronik yang lain.
    4. Umur penderita adalah pengakuan yang bersangkutan tentang umurnya berdasarkan ulang tahun terakhir.
    5. Komedo adalah lesi kulit yang akibat penyumbatan folikel pilosebasea oleh sebum yang rata atau agak menonjol tanda kemerahan.
    6. Lesi inflamasi adalah lesi pada kulit dengan tanda kemerahan.
    7. Penghitungan umlah komedo, lesi inflamasi dan kista pada wajah penderita AV dilakukan dengan menggunakan metode huruf Z.
    8. Fotografer medik: hasil foto dari posisi depan, samping kiri dan kanan dengan jarak pemotretan sejauh 20 cm, dengan menggunakan kamera digital Nikon 10 megapixels.
    9. Biospesimen adalah darah yang diambil dari vena mediana cubiti sebanyak 1cc dengan menggunakan spuit steril yang disposable, dimasukkan ke vacutainer dengan EDTA.

10.  PCR-sequencing adalah teknik PCR yang dilanjutkan dengan sekuensing untuk menentukan urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA.

 

  1. J. KRITERIA OBJEKTIF

–          Polimorfisme Promoter Gen TNF-α -308 :

Positif : bila terdapat variasi genotip GA, AA

Negatif : bila tidak terdapat variasi genotip GA, AA.

–          Akne vulgaris ringan : bila terdapat jumlah komedo kurang dari 20, atau lesi inflamasi kurang 15, atau jumlah lesi total kurang dari 30 buah.

 

  1. K. PENGOLAHAN DATA

Data dalam penelitian ini akan diolah dengan bantuan komputer, program statistik yang digunakan SPSS versi 17.0. Semua hasil analisis akan disajikan dalam bentuk tabel atau grafik disertai dengan penjelasan. Untuk uji hipotesis analisis dengan menggunakan uji Mann Whitney U test. Hipotesis diterima bila nilai P< 0,05 dengan interval kepercayaan 95%

 

 

  1. L. IJIN PENELITIAN DAN ETHICAL CLEARANCE

Permintaan ijin dari pasien dan orang tua pasien untuk dijadikan sampel penelitian, serta persetujuan dari Komisi Etik Penelitian Biomedik pada manusia Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

  1. A. Hasil Penelitian

Penelitian dilakukan di Makassar, Provinsi Sulawesi Selatan dengan mengambil sampel penderita AV ringan. Sampel penelitian untuk penderita yang memenuhi kriteria diperoleh dari RS Perjan Dr. Wahidin Sudirohusodo dan RS Jejaring pendidikan Unhas di Makassar. Spesimen berupa darah yang diambil di vena mediana cubiti sebanyak 1 ml dan dilakukan PCR yang dilanjutkan dengan sekuensing.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan polimorfisme promoter gen TNF-α -308 pada penderita AV ringan. Dua puluh satu penderita AV ringan yang terdaftar dalam rekam medis RS Wahidin Sudirohusodo dan RS jejaring pendidikan Unhas diikutkan dalam penelitian ini. Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan molekuler dengan menggunakan metode PCR untuk melihat pita DNA dari kelompok sampel kasus AV ringan, kemudian dilanjutkan dengan PCR-sekuensing untuk menentukan urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA.

Dari 21 sampel AV ringan ditemukan klasifikasi umur 16-22 tahun sebanyak 17(81%), umur 23-30 tahun sebanyak 2 (9,5%) hal yang sama ditemukan pada kelompok umur 31-39 tahun. Rata-rata umur untuk kelompok kasus adalah ±21,90. (Grafik. 1)

 

 

Grafik 1. Distribusi umur kelompok AV ringan

 

Grafik 2. Menunjukkan distribusi jenis kelamin pasien AV ringan, sebagian besar pasien adalah wanita 17(81%), sedangkan laki-laki sebanyak 4(19%).

Grafik 2. Distribusi Jenis kelamin kelompok AV ringan

 

 

Grafik 3. Mendeskripsikan distribusi masing-masing suku pasien AV ringan, sebagian besar merupakan suku Makassar 13(61,9%), Bugis 3(14,3%), Mandar, Jawa dan Toraja masing-masing 1(4,8%) dan suku lainnya 2(9,5%).

 

Grafik 3. Distibusi suku kelompok AV ringan

 

Elektroforesis produk PCR pada kelompok sampel penderita AV ringan menunjukkan dominasi positif terdeteksi pada target band 605 bp. (Gambar 1)

 

Ket.: K1 – K14 ; Pita DNA penderita akne vulgaris ringan

Gambar 1. Hasil elektroforesis produk PCR pada kasus AV ringan

Hasil sekuensing promoter gen TNF-α posisi-308 dapat dilihat pada Gambar 2. Pada kelompok kasus ditemukan frekuensi genotif GG sebanyak 21 sampel dan tidak ditemukan genotif GA dan AA. (Tabel 1).

 

Gambar 2. Gambaran hasil sekuensing alel G

Tabel 1. Hasil Sekuensing Alel Promoter Gen TNF-α Pada Posisi -308

Kelompok Kasus.

 

Alel

Kasus

G

GA

A

K1

+

 

 

K2

+

 

 

K3

+

 

 

K4

+

 

 

K5

+

 

K6

+

 

 

K7

+

 

 

K8

+

 

 

K9

+

 

 

K10

+

 

 

K11

+

 

 

K12

+

 

 

K13

+

 

K14

+

 

 

K15

+

 

 

K16

+

 

K17

+

 

 

K18

+

 

 

K19

+

 

 

K20

+

 

 

K21

+

 

 

Jumlah

21

0

0

 

 

Ditemukan ekspresi genotip GG pada kelompok kasus akne vulgaris ringan (100%) dibandingkan dengan kelompok normal (95%). Frekuensi alel G pada sampel kasus sangat dominan bila dibandingkan dengan jumlah alel A, dengan demikian pada penelitian ini alel G lebih merefleksikan gambaran penderita akne vulgaris ringan dibandingkan alel A. Berdasarkan uji statistik dengan menggunakan Chi-Square Test didapatkan nilai P=0,306 menunjukkan bahwa tidak terdapat hubungan secara signifikan antara polimorfisme genotipe promoter gen TNF-α posisi -308 dengan penderita akne vulgaris ringan.(Tabel 2).

 

Tabel 2. Frekuensi Genotip Promoter Gen TNF-α Kelompok Kasus dan Kontrol

Frekuensi Genotif

Kasus

n(%)

Normal

n(%)

P value

(Chi-Square Tests)

GG

21(100%)

19 (95%)

0.306

GA

0(0%)

1(5%)

 

Nilai p < 0,005

 

Tabel 3. Menunjukkan perbandingan antara sebaran frekuensi genotif TNF-α -308 pada populasi yang telah melakukan studi sebelumnya untuk melihat adanya hubungan antara polimorfisme dengan akne vulgaris. Ditemukan bahwa terdapat perbedaan frekuensi genotif G/A + A/A pada ke empat penelitian tersebut (Turki; 66,9%, Rumania; 33,2%, Polandia; 34,6%, dan hasil penelitian ini 0%). Data penelitian ini sangat jauh berada di bawah hasil ketiga penelitian tersebut dikarenakan jumlah sampel penelitian ini lebih kecil.

Tabel 3. Perbandingan Kelompok Frekuensi Genotif Promoter Gen TNF-α

-308 Pada Beberapa Populasi (Penelitian Akne)

Populasi

GG,n (%)

GA, n (%)

AA, n (%)

Turki

16 (30,1)

15 (66,7)

1 (3,2)

Rumania

153 (66,8)

72 (31,4)

4 (1,8)

Polandia

49 (65,4)

25 (33,3)

1 (1,3)

Zakiyah S dkk

18 (85,7)

3 (14,3)

0(0)

Studi kami

21 (100)

0 (0)

0 (0)

 

Pada penelitian untuk akne vulgaris, semua hasil sekuensing dibandingkan dengan full sequencing promoter gen TNF-α sepanjang 605 basepair (bp) rujukan dari gene bank dengan menggunakan program BLAST (basic local alignment search tool) (alert-2) dari webside: NBCI dan tidak ditemukan mutasi baru selain pada posisi -308 seperti yang disampaikan pada hasil tersebut.

 

  1. B. Pembahasan

Pada perkembangan lesi akne vulgaris, perubahan morfologis paling awal terjadi pada unit pilosebasea, terjadi keratinisasi folikel yang abnormal. Hiperkeratosis folikel dan produksi sebum meningkat sehingga menghasilkan terbentuknya mikrokomedo, perubahan folikel, dan pertumbuhan P. acnes yang intensif.

P. acnes kemudian akan mengeluarkan beberapa produk proinflamasi termasuk lipase, protease, hialuronidase, dan faktor kemotaktik. Faktor kemotaktik yang diproduksi oleh P. acnes tersebut kemudian menarik sel-sel sistem imun seperti neutrofil, monosit, dan limfosit. Mikrokomedo atau komedo kemudian dapat berkembang menjadi lesi inflamasi sebagai akibat dari aktivasi dan migrasi sel T CD4+, produksi sitokin oleh keratinosit, makrofag, dan neutrofil, faktor hormonal dan peningkatan produksi sebum.(Gollnick H et.al., 2003, Gottenberg JE et.al., 2004, Graham GM et.al., 2004)

Sitokin proinflamasi (IL-1 alpha, IL-8, dan TNFα) adalah mediator utama yang bertanggung jawab sebagai mediator inflamasi pada akne. Telah dibuktikan bahwa P. acnes merangsang produksi sitokin dari limfosit, monosit, dan keratinosit. Kedua hal tersebut, yaitu P. acnes dan faktor-faktor seluler menginduksi produksi sitokin proinflamasi termasuk TNF-α, IL-1 alpha, granulosit/makrofag coloni stimulating factor (GM-CSF), IL-1 beta, dan IL-8. (Jain A et.al., 2003, Graham GM et.al., 2004)

Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) adalah suatu sitokin proinflamasi yang sangat kuat menginduksi respon inflamasi dan sebagai kunci pengatur sistem imun bawaan. Kemudian memicu ekspresi molekul mayor histocompatibility complex (MHC) klas I pada sel T yang teraktivasi, mempromosikan IL-2, proliferasi sel T dan kofaktor dalam proliferasi sel B untuk memproduksi imunoglobulin.

Dalam penelitian ini digunakan promoter gen TNF-α pada posisi -308 berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Baz K et al. (2008) terhadap 113 pasien akne berkebangsaan Turki, yang hasilnya menggambarkan adanya peningkatan frekuensi genotip promoter TNF-α pada posisi -308 pada pasien akne vulgaris pada populasi Turki (p = 0,001, OR 4,054, 95% CI 2.090-7,865), penelitian ini dibandingkan dengan penelitian sebelumnya di Turki ; 80 sampel (p = 0,4), di Iran ;113 sampel (p = 0,2) dan Korea;125 sampel (p = 0,78) yang hasilnya tidak ada perbedaan signifikan. Sementara bila dibandingkan pada kelompok di Inggris genotif GA yang meningkat; 35,5% (p < 0,001), di Italia (27,7%) dengan frekuensi genotif GG (p < 0,001) menurun. Hal ini menandakan adanya variabilitas hasil promoter gen TNF-α pada setiap kelompok suku (Baz K.et.al).

Penelitian mengenai gen-gen lain yang terkait dengan patogenesis akne vulgaris ringan juga penah diteliti oleh Martha P dkk. terhadap polimorfisme gen CYP17 pada kasus AV ringan di Makassar diperoleh frekuensi genotip GG sebanyak 6 kasus (28,6%), genotip heterozigot GA sebanyak 9 kasus (42,8%) dan genotip homozigot AA sebanyak 6 kasus (28,6%). Sedangkan penelitian polimorfisme gen CYP1A1 terhadap kelompok AV ringan yang dilakukan Evi M dkk. diperolah hasil homozigot CC menunjukkan risiko yang meningkat signifikan dibanding homozigot TT dan heterozigot TC dari tempat inisiasi translokasi dalam gen CYP17. Polimorfisme T/C pada daerah promoter gen CYP17 merupakan salah satu lokus yang paling mungkin dalam mengalami akne vulgaris ringan di Makassar.

Pada penelitian yang dilakukan oleh Zakiyah S dkk. Pada promoter gen TNF-α pada kelompok akne vulgaris berat di Makassar ditemukan frekuensi genotif GG sebesar 85,7% dan frekuensi genotif GA 14,3%, tampak bahwa frekuensi genotif GG yang sangat meningkat dan frekuensi genotif GA yang menurun, bahkan tidak ditemukan frekuensi genotif AA. Penelitian lain yang dilakukan di Turki oleh Baz et.al., ditemukan distribusi genotip pada 32 pasien akne vulgaris ringan, ekpresi genotip GG 16(50%), GA 15(46,8%) dan AA1(3,2%). Hal ini sesuai dengan hasil yang kami dapatkan bahwa frekuensi genotip GG dominan ditemukan pada kasus akne vulgaris ringan dan kelompok kontrol. Pada kelompok kontrol ditemukan frekuensi genotip GA 1(5%). Substitusi Guanin (G) ke Adenin (A) dihubungkan terhadap meningkatnya kerentanan seseorang menderita penyakit inflamasi kronik termasuk akne vulgaris, sedangkan pada penelitian ini tidak ditemukan subsitusi G/A pada kasus akne vulgaris ringan, frekuensi genotip yang ditemukan adalah dominan GG. Adanya satu ekspresi genotip GA pada kelompok kontrol diduga mungkin sampel tersebut memiliki riwayat akne vulgaris tetapi saat dilakukan pengambilan darah, sampel tersebut tidak sedang menderita akne vulgaris.

Berdasarkan uji statistik bahwa tidak terdapat hubungan yang bermakna antara polimorfisme promoter gen TNF-α -308 dengan kerentanan menderita akne vulgaris ringan (p=0,306). Hal ini menunjukkan bahwa polimorfisme promoter gen TNF-α -308 tidak mempengaruhi kerentanan menderita akne vulgaris ringan. Sesuai dengan hasil penelitian di Turki ditemukan tingkat keparahan menderita akne vulgaris tidak berhubungan dengan genotip TNF-α. Hal ini disebabkan karena ekpresi genotip TNF-α sangat berkaitan dengan HLA individu dan dipengaruhi oleh suku seperti yang ditemukan pada penelitian yang dilakukan oleh Baz et.al. pada beberapa suku yang berbeda, didapatkan bahwa frekuensi heterozigot genotif G/A sangat rendah pada suku Asia (8-18%) bila dibandingkan dengan penelitian pada suku Eropa (27-35,5%). (Baz K.et.al.)

Penelitian lain oleh Szabo K et.al. (2010) telah meneliti genotip atau frekuensi alel pada   posisi -1031T>C,   -857C>T, -863C>A, -308G>A dan -238G>A yang telah diduga memegang peranan pada perkembangan reaksi inflamasi pada akne vulgaris. Hasil yang didapatkan tidak ada perbedaan yang signifikan pada frekuensi alel antara kelompok kasus dan kelompok kontrol pada posisi -1031, -863, -238 SNPs, sedangkan pada posisi            – 857C>T didapatkan hasil yang signifikan (P = 0,010) antara alel C mayor dan akne, serta pada alel A minor posisi -308 terjadi peningkatan pada pasien akne terutama pada wanita (Szabo K. et.al.). Hasil penelitian yang dilakukan pada populasi di Polandia terhadap 84 pasien akne vulgaris (umur >20 tahun) pada posisi antara -238 dan -308 ditemukan bahwa promoter gen regio TNFα pada posisi tersebut tidak berperan pada patogenesis akne vulgaris. Pada penelitian ini, kami tidak menemukan polimorfisme selain posisi -308 dan juga tidak ditemukannya mutasi baru yang lain seperti pada penelitian sebelumnya di negara Turki maupun Rumania. Hal ini dapat disebabkan oleh karena pada penelitian ini jumlah sampel sangat sedikit sehingga kemungkinan untuk suatu polimorfisme sangat kecil.

Berbagai penelitian gen TNFα pada penyakit yang terkait beberapa polimorfisme nukleotida tunggal telah teridentifikasi di dalam promoter gen TNF-α manusia. Hal ini juga dihubungkan dengan peningkatan kerentanan terhadap berbagai penyakit. Penelitian di Chili yang dilakukan oleh Jimena et.al. terhadap genotip TNF-α menyimpulkan bahwa terdapat perbedaan dalam penyebaran alel TNF-α berdasarkan etnis dan populasi yang mempunyai proporsi tinggi alel TNFα juga kemungkinan mempunyai peningkatan predisposisi terhadap atau mengenai insidensi beberapa penyakit metabolisme kronik, penyakit degeneratif, inflamasi dan penyakit autoimun (Jimena et.al.).

Beberapa penelitian mengenai analisis alel-alel TNFα pada pasien AV telah dipublikasikan Szabo et.al. menganalisis polimorfisme promoter gen TNF-α pada populasi AV di Timisoara Rumania, yang menganalisis polimorfisme 5 promoter gen pada posisi -238G>A, -308G>A, 857C>T, 863C>A dan – 1031T>C pada kelompok akne dan kelompok kontrol. Posisi gen tersebut dipilih atas dasar bahwa pada posisi ini telah terbukti adanya hubungan antara variasi inflamasi dengan sistem imun penyakit seperti penyakit inflamasi Bowel disease, COPD, artritis rematoid, pemfigus dan penyakit Grave (Szabo et.al., 2010).

Bila dibandingkan dengan penelitian yang telah dipublikasikan, kami mendapatkan data frekuensi dari alel minor yang terdiri atas genotif G/A + A/A yang berbeda pada empat penelitian yaitu; populasi Turki (50%); populasi Polandia/Eropa Barat (34,6%); populasi Timisoara/Rumania (24,6%), penelitian oleh Zakiyah S dkk. pada akne vulgaris berat sebesar 14,3%, sedangkan pada penelitian kami tidak ditemukan. Data yang kami peroleh ini berada di bawah ketiga populasi tersebut diatas. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat keragaman hasil dari setiap alel minor dari beberapa populasi yang berbeda, dan ini sesuai dengan saran dari penelitian oleh Jimena et.al. bahwa perubahan sepasang pada regio promotor gen TNF, yang terkandung dalam klaster gen HLA kelas III pada satu atau dua kopi kromosom 6, bisa berakibat pada peningkatan resiko terhadap berbagai penyakit, tergantung pada suku (Jimena Cuenca, 2001).

Sejauh ini, melalui telaah kepustakaan belum ditemukan laporan penelitian mengenai promoter gen TNF-α pada posis -308 pada penderita AV di Indonesia. Pada penelitian ini, promoter gen TNF-α menunjukkan target band terdeteksi positif hampir semua pada kelompok kasus akne vulgaris yaitu pada 605 bp. PCR-sekuensing kelompok kasus menunjukkan jumlah alel G pada kasus sebesar 100% sedangkan jumlah alel A pada kasus tidak ditemukan. Dengan demikian frekuensi ditemukannya alel G pada promoter gen TNF-α posisi -308 pada penderita AV ringan dominan bila dibandingkan dengan frekuensi alel A. Dari hasil frekuensi distribusi sebaran genotip juga tidak ditemukan genotif AA mutan (0%), hal ini berbeda dengan penelitian di Turki yang mendapatkan 4 kasus genotip AA dari 113 kasus (3,5%) sedangkan penelitian di Rumania 4 kasus dari 229 kasus (1,8%) (Szabo et.al., 2010, Baz et.al., 2008).

Sehubungan dengan hasil sekuensing yang dihubungkan dengan gambaran klinis pada sampel kasus penelitian ini diperoleh frekuensi genotip GG pada semua kasus, sehingga dapat dikatakan bahwa klinis AV ringan pada penelitian kami tidak berhubungan dengan faktor genetik inflamasi dalam hal ini promoter gen TNF-α -308 G>A. Diperlukan sampel yang lebih banyak lagi untuk melihat kemungkinan hasil yang berbeda dengan kemungkinan untuk mendapatkan frekuensi genotip homozigot mutan atau mutasi baru pada posisi lainnya seperti pada penelitian sebelumnya.

Apakah promoter gen TNF-α posisi tertentu berperan sebagai faktor kerentanan penderita akne ringan pada populasi di Indonesia, perlu dikonfirmasikan dengan penelitian lebih lanjut yang menggunakan sampel lebih besar dan populasi etnik yang berbeda.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BAB V

PENUTUP

  1. A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan maka dapat disimpulkan bahwa:

  1. Panjang pita DNA gen TNFα yang terdeteksi melalui elektroforesis produk PCR adalah 605 bp.
  2. Polimorfisme promoter gen TNF-α -308 pada penderita Akne vulgaris ringan dapat terdeteksi melalui pemeriksaan lanjutan dengan PCR –sekuensing.
  3. Penelitian ini diperoleh pada Akne vulgaris ringan, frekuensi genotif GG sebanyak 21 kasus (100%) dan tidak ditemukan genotif heterozigot GA dan genotif homozigot AA mutan.

 

  1. B. Saran
    1. Sampel dengan kriteria AV ringan yang menitikberatkan pada lesi inflamasi serta sampel kontrol dibutuhkan untuk mendapatkan hasil polimorfisme yang bermakna secara signifikan pada penderita AV ringan.
    2. Jumlah sampel yang lebih besar dan populasi dengan suku yang beragam dibutuhkan untuk mendapatkan hasil polimorfisme yang bermakna secara signifikan pada penderita AV ringan.
    3. Sebagai salah satu faktor yang berperan dalam etiologi AV, dibutuhkan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui peran berbagai gen lain di samping promoter gen TNF-α pada posisi -308.
    4. Pada penelitian lebih lanjut sebaiknya diperiksa kadar TNF-α di dalam darah penderita AV dan dihubungkan dengan polimorfisme promoter gen TNF-α pada posisi -308.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DAFTAR PUSTAKA

Alireza Firooz , R. S., Seyyed Massoud Davoudi , Mansour Nassiri-Kashani 2005 Acne and smoking: is there a relationship? B MC Dermatology.

Ballanger. F., Baudry, P., N’Guyen, J. M., Khammari, A. & Dreno, B. 2006 Heredity: A Prognostic Factor for Acne. Dermatology. 212: 145-149.

 

Baratawidjaja, K. G. 2006 Imunologi dasar, Jakarta, Balai penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

 

Baz, K., Erdal, M., Yazici, A., Soymelez, F., Guvenc, U., Tasdelen, B. & Ikizoglu, G. 2008 Association between tumor necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism at -308 and acne in Turkish patients. Arch Dermatol Res. 300: 371-6.

 

Campbell, N., Reece, J. & Mitchell, L. 2002 Biology, Jakarta, Erlangga.

 

Feldman, S., Careccia, R., Barham, K. & Hancox, J. 2004 Diagnosis and Treatment of Acne. Am Fam Physician. 69: 2123-30.

 

Gawkrodger, D. J. 2003 Dermatology AN ILLUSTRATED COLOUR TEXT, New York, Churchill Livingstone.

 

Gollnick H. 2003 Current concepts of the pathogenesis of acne: implications for drug treatment. Drugs 63: 1579-96.

 

Gottenberg J.E. 2004 Association of transforming growth factor β1 and tumor necrosis factor alpha polymorphisms with anti-SSB/ La antibody secretion in patients with primary Sjogren’s syndrome. Arthritis Rheum 50: 570-80.

 

Goulden, V., Stables, G. & Cunliffe, W. 1999 Prevalence of facial acne in adults. JAm Acad Dermatol. 41: 577-80.

 

Graham G.M. 2004 Proinflammatory cytokine production by human keratinocytes stimulated with Propionibacterium acnes and P.acnes GroEL. Br J dermatol 150:421-28.

 

Group, Q. 2007 QIAampO DNA Mini and Blood Mini Handbook. ICI Americas Inc. USA.

Guy, W. F. 2002 Acne vulgaris. British Medical Journal. 325: 475-9.

 

HARPER JC, F. J. 2008 ACNE VULGARIS.

 

Hatta, M. 2002 Teknik Isolasi dan Pengukuran DNA. Seminar Teknik Isolasi DNA., Makassar, Universitas Hasanuddin.

Hunter J, J. A. S., M.V. Dahl 2003 Clinical Dermatology, Blackwell science

 

Ifor R.Williams, B. E. R., Thomas S.Kupper 2008 Cytokines. dalam Klaus Wolff, L. A. G., Stephen I.Katz, Barbara A. Gilchrest, Amy S. Palley, David J Leffell (Ed.) Fitzpatrick’s Dermatology in General Medicine. seventh ed. New York, Mc Graw Hill.

 

Jain A et al 2003 Inhibition of Propionibacterium acnes-induced mediators of inflammation by Indian herbs. Phytomedicine 10:34-8.

 

Jimena Cuenca, C. A. P., Adam J, Aguirre, Irene Schiattino, Carlos Aguillon 2001 Genetic polymorphism at position -308 in the promoter region of the tumor necrosis factor (TNF) Implications of its allelic distribution on susceptibility or resistance to disease in the Chilean population. Biological research. 34.

 

Kevin C Wang, L. T. Z. 2008 Recent advances in acne vulgaris research: insight and clinical implications. Advances in Dermatology. 24.

 

Lehmann, H., Andrews, J., Holloway, V. & Goodman, S. 2002 Acne therapy: a methodologic review. JAm Acad Dermatol. 47: 231-40.

 

Leslie, B. 2002 Acne, New York, Mc Graw Hill company.

 

Leyden, J. 1998 Topical treatment of acne vulgaris: retinoid and cutaneous irritation. JAm Acad Dermatol. 38: S 1-4.

 

Maria I.Herane., I. A. 2003 Acne in infancy and acne genetics. Dermatology. 24-28.

 

Mustikawati, E., Anwar, A. I., Amin, S., Massi, N., Budu & Bahar, B.(2010) Hubungan Polimorfisme Gen CYP17 dan Peningkatan Kadar Sebum Pada Akne Vulgaris.Dermatovenerelogy Departement. Makassar, Hasanuddin University

 

Nurul, MP., Anwar, A. I., Tabri, F., Massi, N., Budu & Bahar, B.(2010) Peran polimorfisme gen CYP 1A1 pada akne berat. Dermatovenerelogy Departement. Makassar, Hasanuddin Uiversity

 

Pawin, H., Beylot, C., Chivot, M., Faure, M., Poli, F., Revus, J. & Dreno, B. 2004 Physiopathology of acne vulgaris: recent data, new understanding of the treatments. Eur J Dermatol. 14: 4-12.

 

Pelczar, C. E. 1998 Dasar-dasar mikrobiologi I & 2, Jakarta, UI-Press. Plewig, G., Kligmann, AM 1993 Acne and rosacea, Berlin, Springer-Verlag.

 

Sidiropoulos, M. 2006 Back to basic: acne vulgaris:pathogenesis and retinoid therapy. University of Toronto Medical journal. 83: 94-95.

Simpson, N. & Cunliffe, W. 2007 Disorders of the sebaceous glands. dalam Bums, T., Breathnach, S., Cox, N. & Griffiths, C. (Eds.) Rook’s textbook of dermatology. Massachusetts, Blackwell Science.

 

Suryo 1998 Genetika, Yogyakarta, Gadjah Mada.

 

T Hohler, S. G., B Stradmann-Bellinghausen,W Kaluza, E Reuss.K de Vlam, E Veys, E Marker-Hermann 2002 Differential association of polymorphism in the TNF alpha region with psoriatic arthritis but not psoriasis. Ann Rheum Dis. 61: 213-218.

 

Unhas, B. K. d. K. F. 2007 Data Makassar.

 

Webster, G. 2007 Overview of the Pathogenesis of Acne. dalam, Webster, G. & Rawlings, A. (Eds.) Acne and its therapy. New York, Informa healthcare.

 

Yuwono.T 2002 Biologi Molekuler, Jakarta, Erlangga.

 

Zaenglein, A., Graber, E., Thiboutot, D. & Strauss, J. 2008 Acne vulgaris and acneiform eruptions. dalam Wolff, K., Goldsmith, L., Katz, S., Gilchrest, B., Palley, A. & Leffell, D. (Eds.) Fitzpatrick’s dermatology in general medicine. New York, Mc Graw Hill Medical.

Updated: September 7, 2011 — 9:15 pm

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin © 2015 Frontier Theme